Меню

Геномы из России на эволюционном дереве SARS CoV 2

Геномы из России на эволюционном дереве SARS-CoV-2

Молекулярные биологи секвенируют геномы SARS-CoV-2, полученные из проб пациентов в разных точках планеты, биоинформатики сравнивают нуклеотидные последовательности. Анализ возникающих в них мутаций служит для построения филогенетических деревьев, которые показывают родственные связи между разными штаммами вируса. Филогенетический анализ SARS-CoV-2 важен для нескольких практических задач. Выявление родственных связей между разными вариантами вируса позволяет предположительно реконструировать пути его передачи и проследить распространение. Вместе с тем секвенирование большого количества геномов необходимо, чтобы понять особенности эволюции нового вируса, скорость и распределение мутаций, а это очень ценная информация для создания вакцины.

Наиболее популярная глобальная база вирусных геномов — GISAID, любой исследователь после регистрации может загрузить в нее данные своего сиквенса SARS-CoV-2. На текущий момент в этой базе более 34 тысяч геномов со всего мира, и она все время пополняется. Данные из разных стран включаются в филогенетический анализ: специальный алгоритм фильтрует последовательности по качеству, по длине, определяет нуклеотидные замены. Результаты анализа визуализируются на сайте Nextstrain в виде филогенетических деревьев и предположительной реконструкции путей передачи вируса на географической карте. Можно посмотреть общую картину в масштабе всего мира или региона, например, Европы. Можно отфильтровать данные по нашей стране: российские геномы коронавируса на ветвях дерева Nextstrain разбросаны яркими точками, их число увеличивается на глазах, сегодня там 202 генома. Уточним, что в базе GISAD на сегодня 207 геномов из России, но для филогенетического дерева отбирают не все.

Коронавирус мутирует относительно медленно

Первыми на дереве появились геномы из Санкт-Петербурга, их секвенируют и выкладывают в базу GISAD специалисты НИИ гриппа им. А.А.Смородинцева, на сегодня они выложили 136 сиквенсов. Сейчас география значительно расширилась: есть геномы из Москвы, Самары, Пскова, Краснодара, Екатеринбурга, Красноярска, Челябинска, Хабаровска, Якутии, Татарстана, Бурятии и других регионов. Большая их часть секвенирована специалистами ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор». Московские геномы поступают из НИЦ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи, ФНЦ исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова.

Мы поговорили с заведующим лабораторией молекулярной вирусологии в НИИ гриппа Андреем Комиссаровым, автором первых сиквенсов российских геномов на коронавирусном дереве. Его лаборатория проводит тестирование на COVID-19 для города. Кроме того, клинические образцы поступают из стационаров и поликлиник по проекту госпитального надзора над гриппом и ОРВИ, среди них выявляются и геномы коронавирусов, как сезонных, так и нового. Первый геном SARS-CoV-2 специалисты прочитали 15 марта, по словам Комиссарова, он оказался наиболее близок к штамму из Франции.

«Мы быстро включились в процесс сбора геномных данных по коронавирусу, потому что уже давно этим занимаемся по гриппу, — рассказывает Андрей Комиссаров, — мы секвенируем геномы вируса гриппа и выгружаем на тот же сайт. Nextsrain, он же не только про коронавирус, он исходно создавался как сайт Nextflu, был заточен на грипп. По числу проанализированных полных геномов вируса гриппа мы вышли на второе место в Европе после Великобритании. Когда началась история с коронавирусом, мы поняли, что рано или поздно он попадет в Россию, и нужно быть готовыми к генетическому анализу. Как только в марте образцы наконец-то попали к нам в руки, мы буквально за два дня секвенировали первый полный геном».

Какую информацию специалисты получают из прочитанных геномов коронавируса? Прежде всего, анализ числа и распределения мутаций показывает изменчивость вируса, скорость и закономерности его эволюции. «Нас интересует распределение нуклеотидных замен по разным генам, — объясняет Андрей Комиссаров. — Очень интересуют замены в сайтах связывания праймеров различных тест-систем. Анализ сайтов посадки праймеров нужен, чтобы понимать, насколько хорошо работают тест-системы и возникают ли варианты вируса, на которых тест-системы будут работать плохо».

Что касается скорости, то оказалось, что по сравнению с другими ОРВИ-вирусами и с вирусом гриппа SARS-CoV-2 эволюционирует довольно медленно. Скорость его мутирования оценили величиной 8 х10 -4 на сайт в год (правда, она была подсчитана, когда геномов было значительно меньше). По словам Комиссарова, это на порядок меньше, чем у вируса гриппа. О небольшой скорости мутаций говорит и то, что первый секвенированный петербургский геном продемонстрировал пять несинонимичных замен (оказывающих влияние на синтез белка) относительно уханьского штамма, это немного. И это очень хорошо для создания вакцины.

Филогения с географией

Геном SARS-CoV-2 на дереве Nextstrain, поступивший из НИЦ эпидемиологии и микробиологии имени Гамалеи Минздрава России, секвенирован в референс-центре по коронавирусам. Как объяснил руководитель референс-центра Владимир Гущин, это геном вируса, который был выделен от пациента и размножен на культуре клеток, что обеспечило высокое качество сиквенса. Задача исследователей — не просто секвенировать, а пополнять государственную коллекцию вирусов, содержащую живые образцы, которые в любой момент могут быть использованы для проверки тест-систем, создания вакцин и разработки лекарственных препаратов. По словам Гущина, геном вируса, выделенного у московского пациента, оказался близок к штаммам, которые циркулируют в Европе и Северной Америке, но более всего похож на британские штаммы.

Вопросы распространения нового коронавируса по миру и источники его происхождения в каждой стране — одни из самых интригующих. На сайте Nextstrain имеется карта, на которой реконструированы пути передачи вируса. Эту карту можно запустить в анимированном режиме и наблюдать, как цветные линии протягиваются от одной страны до другой, постепенно связывая регионы мира наподобие рейсов авиакомпаний. Параллельно показана динамика ветвления дерева с предположительным временем возникновения новых ветвей. Если верить этой карте, инфекция появилась в России в конце февраля и завезена была из Италии. Но пока что число секвенированных геномов из России слишком мало по сравнению с данными из других стран.

«Любая филогеографическая и филодинамическая реконструкция требует большого массива данных. Тех данных, которые мы имеем сейчас в России, для этого недостаточно, — считает Андрей Комиссаров. — Сейчас самая главная задача — сделать так, чтобы данных из России было много. Очень важно, чтобы как можно больше лабораторий подключались к этому и секвенировали геномы».

С тем, что нужно больше геномов, согласен Георгий Базыкин, профессор Сколтеха, зав. лабораторией молекулярной эволюции Института проблем передачи информации РАН. Его группа занимается филогенетическим анализом геномов SARS-CoV-2 и сотрудничает со специалистами НИИ гриппа с тех пор, как они прочитали первый российский геном. «Для молекулярной филогенетики чем больше последовательностей, тем лучше, — говорит Базыкин. — Но здесь важно не только число. Эти последовательности приобретают силу, если их удается сопоставить с эпидемиологическими данными, если известен не только город, откуда они взялись, не только дата взятия образца, но и детали. Если связать эпидемиологические данные с молекулярными, то мы можем делать гораздо более интересные выводы». Полезные с точки зрения эпидемиологии данные включают маршрут передвижения пациента, если перед заболеванием он посещал какую-то страну или город внутри страны; люди, с которыми он контактировал, — заболевшие, от которых он мог заразиться, и здоровые, которые могли подхватить вирус от него.

Интересно разобраться в том, завозные те или иные варианты вируса или местные. Сначала, в марте, большинство случаев инфекции были завозными. Анализ первого секвенированного российского генома показал, что он расположился внутри большой европейской клады и эволюционно ближе всего к штамму, выделенному во Франции. Как прокомментировал Георгий Базыкин в своем блоге в фейсбуке, это «сильное свидетельство в пользу завоза в Россию из Европы». Постепенно доля завозных случаев инфекции падала и все больше становилось случаев, связанных с местной передачей.

«Интерпретировать с осторожностью»

Насколько точна карта трансмиссии коронавируса на сайте Nextstrain? «В каких-то своих аспектах она точна, в каких-то аспектах совсем неточна, — считает Базыкин. — Создатели ресурса это многократно подчеркивают. Предположим, например, что вы видите две ветви, одну французскую, одну итальянскую, отходящие от одного корня. Был здесь перенос из Италии во Францию или наоборот? Глядя только на дерево, мы этого сказать наверняка не можем. Теперь предположим, что некоторая ветвь включает несколько последовательностей, выделенных у разных пациентов, и все эти случаи — в одном городе. Первая интерпретация, которая приходит в голову — что вирус передается внутри этого города. Но возможно и другое — что все мутации в этой кладе произошли еще до завоза в этот город, там, откуда вирус пришел. Просто у нас не было достаточного количества образцов из того места, откуда он пришел, и мы этого не распознали. Поэтому все результаты филогенетического анализа нужно интерпретировать с большой осторожностью. Особенно аккуратно нужно интерпретировать датировки, потому что это модельные оценки, и в этих моделях делается много предположений».

Читайте также:  Ответы на тест 2 по курсу Педагогические технологии

Как упомянул Комиссаров, первые случаи COVID-19 в России произошли в Тюмени и Забайкальском крае, но их возбудители не были генетически изучены. По мнению Базыкина, если бы те случаи породили вспышки заболевания, то мы бы об этом знали. Возможно, они были успешно изолированы и не распространились. Все же последующие кластеры передачи вируса в России в основном имеют европейское происхождение.

Знания о возбудителе пандемии COVID-19 добываются всем миром, каждая страна вносит вклад в глобальное исследование. Из США и западноевропейских стран поступают тысячи геномов. Количество данных из России пока несопоставимо меньше,. Очень жалко, что в базе мало московских геномов, так как Москва в эпидемиологической ситуации в нашей стране играет основную роль.

В целом, чем больше секвенированных геномов, тем полнее филогенетический анализ, тем точнее реконструкции. Чтобы увеличить российский вклад в глобальное исследование, специалисты НИИ гриппа в Санкт-Петербурге создают консорциум по секвенированию геномов SARS-CoV-2 и приглашают всех к сотрудничеству. Желающих уже много, и ученые надеются, что консорциум заработает в ближайшее время. Готовятся и научные публикации по филогении коронавируса, ждем их на сайте препринтов.

Источник

Как работает экспресс-тест на коронавирус

Тестирование на COVID-19 не только помогает получать информацию о распространенности вируса, но также дает представление о том, как вирус распространился и накопил ли он потенциально значимые мутации. Многие методы тестирования основаны на анализе нуклеиновых кислот. Хотя эти подходы бесценны и позволяют определить активную инфекцию, они не дают полной картины. Как мы можем узнать, заразился ли кажущийся здоровым пациент вирусом? Что, если бы у этого человека не было симптомов носительства, и его обследовали после того, как инфекция прошла? Ответы на эти вопросы может помочь получить экспресс-тест на антитела к коронавирусу.

Что такое экспресс-тест на коронавирус и в чем его отличие от ПЦР

В рамках борьбы с патогенами ваша иммунная система вырабатывает антитела к патогену. Даже после того, как вирус был уничтожен, ваше тело продолжает вырабатывать эти антитела как своего рода иммунную «память», которая дает нам записи о прошлой инфекции. Диагностика с помощью экспресс-теста основана на выявлении этих антител. На данный момент используется иммуноферментный анализ (ИФА), который проводится только в условиях лаборатории, и иммунохроматографический анализ (ИХА), представляющий собой тест-полоску или кассету, на которую наносится капля крови.

Молекулярное тестирование, включая тестирование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), выявляет генетический материал вируса и, таким образом, может определить, инфицирован ли человек SARS-CoV-2 в настоящее время. Серологический анализ, к которым относятся экспресс-тесты, выявляет антитела к вирусу, измеряя количество антител, вырабатываемых после инфицирования, тем самым выявляя, был ли человек ранее инфицирован SARS-CoV-2. Серологические тесты не следует использовать для диагностики острой инфекции SARS-CoV-2, поскольку антитела вырабатываются через несколько недель после заражения.

Что такое IgA, IgG, IgM

Серологические тесты, к которым относится экспресс-тест, — это тесты на основе крови, которые можно использовать для определения того, подвергались ли люди воздействию определенного патогена, по их иммунному ответу. Напротив, тесты ПЦР, которые в настоящее время используются во всем мире для диагностики случаев COVID-19, могут указывать только на присутствие вирусного материала во время инфекции и не указывают, был ли человек инфицирован и впоследствии выздоровел. Эти тесты могут дать более подробную информацию о распространенности заболевания в популяции путем выявления людей, у которых выработались Ig к вирусу.

Экспресс-тесты используется для выявления следующих антител:

  1. IgG — это самый распространенный изотип антител (около 70-75%) в крови. IgG преимущественно отвечает за длительный иммунитет после инфекции.
  2. IgM составляет около 10% антител в крови и сначала вырабатывается в ответ на острую инфекцию.
  3. IgA составляет еще около 10% антител в крови и в первую очередь отвечает за защиту поверхностей слизистых оболочек, поэтому он может быть особенно важен при COVID-19.

Тестирование на все три Ig улучшило информативность результатов по сравнению с любым тестом на одно антитело. Этот тип теста на COVID-19 подтверждает, были ли вы ранее инфицированы SARS-CoV-2. Это исследование не подтверждает, что вы полностью невосприимчивы к COVID-19, поскольку в настоящее время нет доказательств того, что люди не могут заразиться коронавирусом более одного раза. Кроме того, тест на Ig к COVID-19 не показывает, инфицированы ли вы в настоящее время коронавирусом. Если вы хотите узнать, инфицированы ли вы в настоящее время COVID-19, вам нужно пройти диагностику методом ПЦР.

Как интерпретировать результаты экспресс-теста?

Проведение экспресс-тестирования — возможность получить достоверные результаты о наличии циркулирующих антител в крови. Есть 4 возможных результата диагностики:

  1. IgM отрицательный, IgG отрицательный. Нет никаких доказательств текущей инфекции или предыдущей инфекции. Помните, что с момента появления симптомов проходит минимум 4 дня или 7 дней с момента контакта с вирусом, прежде чем антитела окажутся положительными. Это означает, что исследование на Ig не может обнаружить инфекцию на начальных стадиях. Если, несмотря на этот результат, есть подозрение на недавнее заражение, можно провести ПЦР-тест или повторить тест на антитела через несколько дней.
  2. IgM положительный, IgG отрицательный: Это говорит о заражении на ранних стадиях заболевания. Если результат не совпадает с клинической картиной (например, нет симптомов), это могло быть ложноположительным. Результат может быть подтвержден с помощью ПЦР-теста или, если диагностика проводилась экспресс-тестом на антитела, с помощью теста ИФА, который является более надежным и использует другой метод.
  3. IgM-положительный, IgG-положительный: Это говорит о наличии инфекции в промежуточной стадии заболевания. Инфекционность, вероятно, будет низкой.
  4. IgM отрицательный, IgG положительный. Идет выздоровление и пациент не заразен. Может быть выявлен иммунитет к Covid-19, хотя пока неизвестно, в какой степени и как долго этот иммунитет может сохранять свою эффективность для реализации иммунного ответа после повторного проникновения вируса в организм. Меры предосторожности все же следует принимать.

Можно ли делать экспресс-тестирование на ковид дома?

Проведение диагностики с использованием иммунохроматографического анализа возможно и в домашних условиях. Для этого не требуются специальные знания, поскольку к каждому диагностическому набору прилагается краткая инструкция, в которой указано всего несколько действий, позволяющих получить быстрый результат. В большинстве комплектов содержится полоска, пипетка, буферный раствор и скарификатор для прокола кожи. Как правило, исследуемому нужно нанести на полоску каплю крови, а после — несколько капель буфера и подождать, пока уровень жидкости достигнет индикаторов для получения ответа.

С чем связана недостоверность результатов

Негативный результат ИХА экспресс-тестов не всегда отражает реальную картину, поскольку их чувствительность значительно ниже, нежели у ИФА.

Отрицательный результат может означать, что вы:

  1. Не подвергались воздействию вируса, вызывающего COVID-19.
  2. Подверглись воздействию, но иммунная система еще не начала вырабатывать антитела (их активный синтез начинается на 5-6 день после заражения).
  3. У вас слишком низкий уровень антител, поэтому их невозможно обнаружить с помощью иммунохроматографического анализа. Например, потому что вы недавно перенесли инфекцию и еще не выработали антитела, или потому что инфекционный процесс протекал давно и уровни антител успели снизиться.

Кому стоит сделать тест на антитела к коронавирусной инфекции

Экспресс-тест на антитела к коронавирусу — простой метод диагностики, который отличается:

  • невысокой стоимостью;
  • высокой точностью;
  • отсутствием серьезной подготовки (в сравнении с ПЦР);
  • предоставлением информации о наличии иммунитета после инфекционного заболевания;
  • возможностью проведения диагностики на дому.

Проведение этого вида диагностики рекомендовано людям, у которых более 5 дней назад наблюдались симптомы ОРВИ, и тем, кто был в контакте в зараженными коронавирусом, но в течение 14 дней симптомы инфекционного заболевания так и не проявили себя.

Что делать, если результат теста положительный

Позитивный результат означает, что на момент тестирования в вашем организме циркулируют антитела, которые образовались в ответ на заражение коронавирусом. Для получения подробных данных о состоянии иммунной системы рекомендуется дополнительно пройти ИФА диагностику для количественного определения антител острой фазы воспаления. Желательно воспользоваться проведением исследования на дому.

Для получения дополнительной информации о том, что нужно делать вам, всем, с кем вы живете, и всем, кто находится в вашем кругу общения, обратитесь за помощью к вашему врачу и после консультации выполните все инструкции, которые он вам предоставил.

Источник



Генетическая характеристика вируса SARS-CoV-2

DOI: 10.18522/2308-9709-2021-35-4

Данный обзор посвящен рассмотрению генетической характеристики вируса SARS-CoV-2, его структуры и основных способов диагностики. Вирус SARS-CoV-2 представляет собой одноцепочечную молекулу РНК, длина генома вируса варьирует от 29,8 т.п.н. до 29,9 т.п.н. Сравнительный геномный анализ показал, что SARS-CoV-2 относится к группе бета-коронавирусов и очень близок к SARS-CoV. Первоначальный сравнительный геномный анализ показал, что SARS-CoV-2 почти на 79% идентичен SARS-CoV и на 50% идентичен вирусу MERS-CoV. На основе исследований гомологического моделирования было показано, что SARS-CoV-2 на 96,2% гомологичен BatCoV RaTG13, коронавирусу летучих мышей рода Rhinolophus affinis. Исследования по установлению происхождения SARS-CoV-2, показали, что случайные мутации и рекомбинация — два основных источника генетического разнообразия этого вируса. Недавно опубликованные работы показывают, что частота мутаций SARS-CoV-2 примерно такая же, как и в геноме SARS-CoV (0,80–2,38 × 10 –3 нуклеотидных замен на сайт в год). Наиболее частыми типами мутаций в геноме SARS-CoV-2 являются синонимичные и миссенс-мутации. Также в геноме SARS-CoV-2 были обнаружены мутации других типов: нонсенс-мутации, вставки, делеции, мутации некодирующей ДНК.
Обнаружено по крайней мере семь генетически независимых клонов, которые приобрели мутацию в одном конкретном месте Q677H или Q677P гена шипового белка Spike вируса.

Читайте также:  Тест личко для взрослых

Ключевые слова: COVID-19 , коронавирусная инфекция 2019, MERS-CoV, SARS-CoV-2, диагностика, генетическая характеристика

Eng. Genetic characteristics of the SARS-CoV-2

Novikova Irina Alekseevna 1

1 Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russia

This review describes the genetic characteristics of the virus, the main ways to diagnose COVID-19 infection. The SARS-CoV-2 virus is a single-stranded RNA molecule, the length of the virus genome varies from 29.8 kbp. up to 29.9 kb Comparative genomic analysis showed that SARS-CoV-2 belongs to the group of beta-coronaviruses and is very close to SARS-CoV. Initial comparative genomic analysis showed that SARS-CoV-2 is almost 79% identical to SARS-CoV and 50% identical to the MERS-CoV virus. Based on homologous modeling studies, SARS-CoV-2 has been shown to be 96.2% homologous to BatCoV RaTG13, a bat coronavirus of the genus Rhinolophus affinis. Studies to establish the origin of SARS-CoV-2 have shown that random mutation and recombination are two main sources of the genetic diversity of this virus. Recently published works show that the frequency of SARS-CoV-2 mutations is approximately the same as in the SARS-CoV genome (0.80-2.38 × 10-3 nucleotide substitutions per site per year). The most common types of mutations in the SARS-CoV-2 genome are synonymous and missense mutations. Mutations of other types were also found in the SARS-CoV-2 genome: nonsense mutations, insertions, deletions, mutations of non-coding DNA.

At least seven genetically independent clones have been found that have acquired a mutation at one specific site Q677H or Q677P of the Spike virus spike protein gene.

Keywords: COVID-19, coronavirus infection , MERS-CoV, SARS-CoV-2, diagnostics, genetic characteristics

Возникающие и возобновляющиеся эпидемии – это проблема здравоохранения глобального масштаба. Первые случаи болезни, вызванной коронавирусной ‎инфекцией COVID-2019 были обнаружены еще в 2019 году, но и по сей день это заболевание отнимает тысячи жизней. По данным Worldometer на 15 апреля: 2021 г. в мире выявлено 133 717 735 случаев заражения COVID-19 [14]. До сих пор инфицированными остаются 18415472 человек, 107555 из которых находятся в тяжелом состоянии. Россия входит в десятку стран лидирующими по заражению COVID-2019. По данным сайта стопкоронавирус.рф на 15 апреля 21 года за все время в России было инфицировано 4 675 153 человек, из них скончалось 105 928 человек [2]. Изучение структуры SARS-CoV-2 позволило приступить к созданию вакцин, которые уже активно применяются с целью профилактики COVID-2019.

Генетическая характеристика вируса SARS-CoV-2

Понимание генетики SARS-CoV-2 может открыть новые возможности для разработки более эффективных и безопасных методов лечения новых поколений вакцин.
SARS-CoV-2 относится к РНК-вирусам, для которых характерна высокая частота мутаций. Он представляет собой одноцепочечную молекулу РНК, длина генома SARS-CoV-2 варьирует от 29,8 т.п.н. до 29,9 т.п.н. По данным Супотницкого [1] это самый большой вирусный РНК-геном из известных на сегодняшний день. Геном вируса состоит из шести основных открытых рамок считывания (ORF), общих для коронавирусов, и ряда других дополнительных генов.
Сравнительный геномный анализ показал, что SARS-CoV-2 относится к группе бета-коронавирусов и очень близок к SARS-CoV, ответственному за эпидемию атипичной пневмонии, начавшейся в ноябре 2002 года в китайской провинции Гуандун и затем распространившейся на 29 стран в 2003 году.
Впервые последовательность генома SARS-CoV-2 была опубликована в GenBank 11 января 2020 г. (инвентарный номер MN908947.3) [8].
На основании выравнивания последовательностей и анализа эволюционного древа SARS-CoV-2 теперь считается новейшим представителем линии B рода Betacoronavirus (β-CoV) в семействе Coronaviridae порядка Nidovirales. Первоначальный сравнительный геномный анализ показал, что SARS-CoV-2 почти на 79% идентичен SARS-CoV и на 50% идентичен вирусу MERS-CoV, ответственному за развитие ближневосточного респираторного синдрома [18].
Согласно филогенетическому анализу, SARS-CoV-2 больше похож на SARS-CoV, чем на MERS-CoV. Стоит отметить, что на основе исследований гомологического моделирования было показано, что SARS-CoV-2 на 96,2% гомологичен BatCoV RaTG13, коронавирусу летучих мышей рода Rhinolophus affinis [15].

Рис.1 – Геномы коронавирусов типовых видов различных родов (по: М.В. Супотницкий, 2020 [1])

Геном SARS-CoV-2 состоит из положительно смысловой одноцепочечной молекулы РНК с 5′-кэп-структурой и 3′-концевой структурой и поли-A-хвоста, выполняющего роль мРНК для трансляции полипротеинов репликазы[19].
По данным полногеномного анализа, геном β-CoV кодирует несколько неструктурных и четыре структурных белка, включая шип (S), оболочку (E), мембрану (M) и нуклеокапсид (N) [10].
Геном SARS-CoV-2 включает 5′-нетранслируемую область — ORF1/ab-S-ORF3a-E-MORF6a-ORF7a- ORF7b-ORF8-N-ORF10-3 и не содержит ген гемагглютинин-эстеразы (HE), обнаруженный у некоторых вирусов рода β-CoV. Около двух третей РНК SARS-CoV-2 состоит из области ORF1a / b, которая рассматривается как самая большая открытая рамка считывания вместе с 16 неструктурными белками (nsp1-16). Оставшаяся треть генома около 3′-конца содержит открытую рамки считывания, кодирующие структурные и вспомогательные белки [7].

Подобно другим РНК-вирусам генетическое разнообразие SARS-CoV-2 критически важно для его приспособленности, выживания и, вероятно, его патогенеза. Исследовании по установлению происхождения SARS-CoV-2, показали, что случайные мутации и рекомбинация — два основных источника генетического разнообразия этого вируса [6]. В связи с этим в геноме SARS-CoV-2 были идентифицированы девять предполагаемых рекомбинантных паттернов, включая шесть критических областей рекомбинации в гене S и по одному в RdRp, nsp13 и ORF3a соответственно. Недавно опубликованные работы показывают, что частота мутаций SARS-CoV-2 примерно такая же, как и в геноме SARS-CoV (0,80–2,38 × 10–3 нуклеотидных замен на сайт в год) [11]. Согласно GISAID число и частота мутаций значительно выше в Европе и Северной Америке по сравнению с Азией, что предполагает наличие разных паттернов мутаций [13]. J. Kuipers и соавт. [9], статистически проанализировав большое количество «сырых» данных секвенирования из разных лабораторий, показали, что гетерогенность вирусной популяции в образце положительно коррелирует с увеличением возраста пациентов. Образец d186dl477 был получен от 84-летней пациентки. Если принять скорость мутаций, равную максимально возможной (2,38 × 10–3 нуклеотидных замен на сайт в год), то при продолжительности развития заболевания 5 дней в геноме SARS-CoV-2 могло сформироваться до 10 мутаций.

В настоящее время проводится большое количество исследований по обнаружению различных геномных вариантов SARS-CoV-2. Как сообщают Chan и Laamarti [5], наиболее частыми типами мутаций в геноме SARS-CoV-2 являются синонимичные и миссенс-мутации. Также в геноме SARS-CoV-2 были обнаружены мутации и других типов, а именно: нонсенс-мутации, вставки, делеции, а также мутации некодирующей ДНК.

Геномный анализ SARS-CoV-2 в нескольких исследованиях выявил мутации в генах: ORF1ab, ORF3a, ORF6, ORF7, ORF8, ORF10, S, M, E и N [5]. Как сообщается, гены nsp1 nsp2 nsp3, nsp12 и nsp15, ORF1ab, S и ORF8 имеют значительно больше число мутаций, чем другие [15]. Кроме того, в гене ORF1ab были обнаружены две вставки с неизвестными эффектами [16].

По результатам нескольких исследований в различных частях генома SARS-CoV-2 были обнаружены делеции различного типа (в рамке считывания или сдвиг рамки считывания), однако о мутациях в гене M до сих пор ничего не сообщалось. Эти делеции предположительно могут играть определенную роль в вирулентности и патогенезе вируса посредством влияния на третичную структуру и функции вирусных белков, а также на врожденный иммунитет.

Рис.2 – генетическая структура SARS-CoV-2 (по: Alanagreh, Foad Alzoughool, Manar Atoum, 2020[3])

Из-за роли более мутабельных регионов в вирусной репликации, передаче и, соответственно, индуцированных иммунных ответах, необходимы дальнейшие исследования для определения эффектов этих мутаций в патогенезе SARS-CoV-2.

Благодаря исследованию ученых из Великобритании, включающему в себя анализ геномов SARS-CoV-2 от 7500 пациентов по всему миру, удалось установить, что вирус был распространен не «нулевым пациентом». В результате анализа обнаружено 198 мутаций, каждая из которых встречалась более одного раза. Это указывает на то, что SARS-CoV-2 подвергается селективному давлению при адаптации к организму хозяина [7].
В. Куппер в своем недавнем исследовании [9] сообщает, что обнаружено по крайней мере семь генетически независимых клонов, которые приобрели мутацию в одном конкретном месте Q677H или Q677P гена S шипового белка вируса Spike. «Эти вирусные адаптации уже переписывают наши учебники биологии по конвергентной эволюции» —пишет Купер.

Читайте также:  Как проверить кредитную историю все способы

Заключение. Исходя из сообщений о патологии и патогенезе новой коронавирусной инфекции COVID-19, полученных из разных стран, развитие заболевания представляет собой сложную картину взаимодействия различных факторов. Необходимы дальнейшие исследования для определения эффектов мутабельных регионов в патогенезе SARS-CoV-2. Более полное понимание генетической структуры SARS-CoV-2 имеет решающее значение для выработки протоколов диагностики, прогнозирования тяжелого течения инфекции, создания профилактических вакцин, разработки протоколов терапии заболеваний, вызванных SARS-CoV-2, а также другими вновь появляющимися инфекциями.

Источник

Чем представлен генетический материал вируса sars cov 2 тест

Своевременная и качественная диагностика – один из ключевых факторов в борьбе с COVID-19: диагностика необходима и для оценки общей эпидемиологической ситуации, и в случае принятия решения по каждому конкретному пациенту. По данным сайта стопкоронавирус.рф на 12.05.2020 г. проведено более более 5,8 миллионов тестов на наличие нового коронавируса. Цифра огромная. Однако, насколько достоверны результаты? Появляется все больше историй о типичной картине COVID-19 при отрицательных анализах. Почему так может происходить?

Какие тест-системы сейчас используются, каковы их достоинства и недостатки, и почему некоторые регионы страны переходят на диагностику с помощью компьютерной томографии разберемся в этой статье . Все это важно знать фармацевтическим работникам, чтобы быть в курсе текущих событий и грамотно отвечать на вопросы, которые клиенты неизбежно задают и будут задавать людям в белых халатах.

Сначала поговорим о ПЦР-тестах, которые специфически выявляют РНК вируса в пробах.

Взятие пробы для ПЦР

Показано, что для выявления нового коронавируса подходят смывы из носоглотки – из ротоглотки вероятность ложноотрицательного анализа немного выше [ 1 ]. Один из важнейших аспектов – время взятия материала. Проведенные исследования показывают, что при взятии материала у больного в первый день проявления симптомов COVID-19 положительный диагноз поставят с вероятностью 94 %, а вот к 10-му дню это будет всего лишь 67 %! [ 2 ].

Существует четкая закономерность: чем позже от возникновения симптомов взят материал, тем меньше шансов обнаружить в нем вирусную РНК.

Есть и хорошие новости: в течение первой недели от возникновения симптомов носоглоточные смывы имеют порядок от 100 000 до 1 000 000 копий вирусной РНК в 1 мл, что делает их легко обнаруживаемыми даже не самыми чувствительными системами. Исследования также показали, что вирусная нагрузка в верхних дыхательных путях может быть одинаковой у людей с проявленной симптоматикой и при бессимптомном течении болезни [ 3 ].

Транспортировка и хранение проб для ПЦР

Хранить образцы рекомендуется при температуре 2-8°C не больше 72 часов (более длительное хранение требует заморозки на -70°С и ниже) [ 4 ]. Соответственно, при нарушении температурного режима вероятность ложноотрицательного результата также повышается. Из-за перегруженности лабораторий, можно предположить, что большая часть образцов не хранится перед анализом надлежащим образом.

Точность разных ПЦР-тест-систем

После попадания образцов в лабораторию правильность диагноза будет зависеть во многом от тест-системы, которую там используют. На сегодняшний день помимо двух тест-систем, разработанных еще в январе в ГНЦВБ «Вектор», зарегистрировано 8 ПЦР-тест систем [ 5 ]:

    АмплиТест SARS-CoV-2; разработан ФГБУ «Центр стратегического планирования» (ЦСП) Минздрава РФ, Москва;

АмплиСенс CoVs-Bat-FL (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва);

Поливир SARS-CoV-2 (ООО «НПФ «Литех», Москва совместно с ФМБА и НИЦЭМ им. Гамалеи);

РеалБест РНК SARS-CoV-2 (АО «Вектор-Бест», Новосибирск, Кольцово);

набор реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2 и подобных SARS-CoV (ООО «ДНК-Технология-ТС», Москва);

набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России);

SBT-DX-SARS-CoV-2 (ООО «Система-БиоТех»);

набор ООО «МедипалТех» из Дубны (производителем указано ООО «Амплитек»).

Из них системы «Вектора» и «Вектор-Беста» (последняя через сеть лабораторий «Инвитро» [ 6 ]) используются для исследования проб от государственных медицинских организаций. Здесь хочется отметить, что система «Вектора» не содержит в своем составе внутреннего контрольного образца, который должен добавляться во все пробы для контроля правильности выделения РНК и реакции обратной транскрипции [ 7 ]. Отсутствие такого контроля может также потенциально приводить к некоторому количеству ложноотрицательных результатов. Хорошая новость заключается в том, что остальные зарегистрированные тест-системы имеют в своем составе внутренний контроль, а также, по-видимому, обладают более высокой чувствительностью, т.е. дают меньше ложноотрицательных результатов.

Что касается частных клиник, то компании «Хеликс» [ 8 ] и «Гемотест» [ 9 ] заявляют, что они используют систему ГНЦВБ «Вектор», в то время как CMD и «Ситилаб » используют более современные системы ЦНИИ Эпидемиологии и ДНК-технологии, соответственно [ 10 , 11 ].

Таким образом, в городах, где представлены сетевые лаборатории, есть возможность сдать анализ частным образом и надеяться на точность проведения процедуры. В первые дни появления симптоматики точность будет выше.

Экспресс-системы

Что касается экспресс-тест-систем, то есть опасения, что созданные в сжатые сроки «уникальные» тесты по своему качеству будут уступать системам, основанным на обычной ПЦР. Насколько надежны эти системы покажет время, однако уже сейчас количество ложноотрицательных результатов ПЦР в совокупности с длительностью ожидания результата привело к тому, что в клиниках страны диагноз стали ставить не на основе ПЦР-анализа, а на основе результатов компьютерной томографии (КТ).

КТ

Преимущество КТ-диагностики при наличии клинической картины – это скорость постановки диагноза и более высокая чувствительность по сравнению с реальностью ПЦР-диагностики: 97,2 % против 83,3 % согласно данным небольшого китайского исследования [ 12 ]. Начиная с 4-5 дня заболевания можно различить так называемый симптом «матового стекла», на стадии прогрессирования такие участки консолидируются, возникает симптом «булыжной мостовой», «обратного ореола», а в пиковая стадии – «белое легкое» [ 13 ]. Возникает закономерный вопрос: отличается ли картина пневмонии, вызванной именно новым коронавирусом, от заболеваний другой вирусной природы. Ответ – нет. Вирусные пневмонии, будь то аденовирус, грипп или другие респираторные вирусы, выглядят на КТ одинаково.

Однако в условиях пандемии, когда подавляющее большинство вирусных пневмоний имеют коронавирусную природу, использование КТ для диагностики становится более чем оправданным. В последней версии методических рекомендаций Минздрава по профилактике, диагностике и лечению COVID-19 указано, что «наличие клинических проявлений в сочетании с характерными изменениями в легких по данным КТ или обзорной рентгенографии органов грудной клетки вне зависимости от результатов однократного лабораторного исследования на наличие РНК SARS-CoV-2 и эпидемиологического анамнеза» является клинически подтвержденным случаем COVID-19 [ 14 ]. Отметим также, что объем поражения легких при РГ и КТ может не иметь прямой корреляции с клинической тяжестью заболевания.

ИФА (иммуноферментный анализ)

ПЦР-тест-системы, как и КТ-диагностика выявляет COVID-19 в острой фазе. Однако весьма актуальна и информация об уже переболевших, на основании которой можно судить об охвате населения заболеванием, а также о числе бессимптомных случаев. Ответы на эти, а также на многие другие вопросы, может дать тест-система на антитела. На сегодняшний день разработкой таких тест-систем помимо «Вектора» занимаются такие организации как «Вектор-Бест», «НПО «Диагностические системы», ФНКЦ ФХМ ФМБА России, «МБС-Технологии», а также «Генетико» и Институт молекулярной биологии РАН [5]. К сожалению, тест-системы на антитела требуют намного больших усилий и времени на разработку, чем ПЦР-системы, а их чувствительность и специфичность оставляет желать лучшего. Так, проведенное в США исследование доступных система на антитела показало, что лишь 3 из 14 систем дают надежные результаты (т.е. не более 1% ложноположительных результатов), но при этом их чувствительность не превышает 90% относительно положительных контрольных образцов [ 15 ]. Какова будет чувствительность и специфичность разрабатываемых российских систем – пока неизвестно.

Итак, самое разумное, что вы можете сказать клиентам:

    Если у вас первые пять дней симптомов – вполне можно сдать пробы для ПЦР-диагностики в частных центрах, в идеале, заказав выезд специалистов на дом. Желательно тестироваться в тех лабораториях, которые используют системы с контрольными образцами, о чем мы писали выше.

Если тест дал отрицательный результат или прошло больше пяти дней от начала болезни, а симптомы сохраняются, то в этом случае можно сделать КТ, при этом соблюдать все меры предосторожности, ведь в очереди запросто могут оказаться люди с новой коронавирусной инфекцией.

Проводить ИФА при текущей низкой точности – едва ли имеет смысл.

  • Если у вас нет симптомов, но был контакт, то можно пройти ПЦР-диагностику, но лучше всего на 14 дней уйти на самоизоляцию и наблюдать за самочувствием.
  • Регистрируйся на нашем сайте и получай доступ ко в сем материалам о COVID-19 в специальном разделе.

    Отвечаем на вопросы в прямых эфирах Вконтакте: https://vk.com/pharmznanie

    Обсудить последние новости со всеми коллегами России вы можете в чатах:

    Источник